蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)

エレクトロスプレーイオン化－質量分析 (ESI-MS)

 質量分析 (MS) は、無機、あるいは有機化合物を適正な方法でイオン化し、生成したイオンを質量電荷比 (m/z) の差に基づいて分離して、各々の m/z のイオン量を測定することで定性・定量分析をする手法です。
 m/zはイオンの質量を原子質量単位の数値を m とし、これとイオンの電荷数 z の比を表したもので、z の値は１となることが多く、この時 m/z の値はイオンの原子質量に対応します。
 イオン化された m/z の値を計測するための方法には飛行時間型 (TOF) や四重極型 (Q) など、様々な方法が存在しています。

 例えばTOFでは、一定距離の電場中でイオンを加速させた後、それを電場のない空間に射出します。
 電場中のイオンの加速度は m/z に依存し、加速後の飛行速度は m/z に反比例するため、これを計測することで m/z を特定することができます。
 また、四重極型はイオンの通り道が4本の電極で構成されており、電極に印加する交流電圧を制御することで任意の m/z のイオンのみ通すことができます。

 質量分析は続けて行うことも可能で (タンデム質量分析)、質量分析を続けてn回行うときMSⁿと表記します。
 特に2回行うことが一般的でこの時はMS/MSと表記されます。
 MS/MSは特定の分子を開裂 (フラグメンテーション) させ、分子内の官能基や骨格の有無、およびこれらが共通してもっているイオン群などの分子の構造情報を与えます。
 MS/MSでは、先ほど説明した四重極を3つ連結させたトリプル四重極MSや、2つの四重極とTOFを連結したQ-TOF-MSがよく用いられます。

 トリプル四重極を構成する3つの四重極はそれぞれQ1、Q2、Q3と呼ばれ、分析を行う際にはQ1で開裂の元となるプリカーサーイオン (正確にはその m/z ) を選んで通過させ、Q2のコリジョンセルで不活性化ガスに衝突させフラグメンテーションを起こさせます。
 Q3でこれらのフラグメントイオンを分析することで構造情報を読み取るのです。Q-TOFはこのQ3がTOFに置き換わった構造をしており、感度はトリプル四重極MSより低下しますが、より正確なフラグメントイオンの m/z を取得することができます。
 以下の画像は装置紹介のページで紹介したDOPCをQ-TOF-MSで測定したMS/MSデータです。
 先端のホスファチジルコリン部分が m/z = 184.0692 として検出されており、ほかにも様々なフラグメントイオンが検出されていることがわかります。
 エレクトロスプレーイオン化法 (ESI) は電圧をかけられたスプレー上の試料出口から液滴として放出された試料溶液に、窒素などのガスを吹き付け、強制的に溶媒を蒸発させると最終的にその分析対象物本体に電荷がのり、イオン化を完了させる方法です。
 これによってイオン化された分子がMSに送り込まれ m/z の検出が行われます。
 当研究室では、これを先端が2-4 µmほどのガラスニードルで行うナノエレクトロスプレーイオン化法 (nanoESI) を用いて研究を行っています。
 nanoESIでは、放出される試料液滴が小さいため、窒素ガスの吹き付けがいらないことや、溶液の流量が非常に少ないため、最小限の試料消費で分析を行うことができます。

キャピラリー電気泳動 (CE)

 内径が50 µm ほどの“管”を用いてその中で電気泳動を行う手法をキャピラリー電気泳動 (CE) と呼びます。
 この“管”－キャピラリー－の内部表面は一般的にシラノール基 (Si-OH基) が露出しており、これが電離することで負に帯電しています。
 電気的中性の原理から泳動液中の陽イオン (主にプロトンH⁺) が表面に近接して存在します。
 ここに電圧を印加すると、表面近傍に存在する陽イオンが陰極側へと移動し、それに伴って地滑りを起こすように泳動液全体が陰極側へと移動します。
 この溶液の流れは電気浸透流 (EOF) と呼ばれています。
 この泳動液の中に分離したいイオンが存在していた場合、正電荷を持つイオンはEOFの流れ＋自身の電荷による速さで、負電荷を持つイオンはEOFに逆らうように流れていくのでこの速さの違いによりイオンを分離することができます (残念ながら陰イオンの陽極に向かう早さよりもEOFの方が速いため、いつかは必ず陰イオンも陰極側に流されてしまうのである)。


 CEでは試料溶液の濃縮も行うことができ、より高感度な分析をすることが可能です。
 ここではLDIS法 (Large-volume Dual preconcentration by Isotachophoresis and Stacking) を例にとって説明します。
 LDISでは、まずキャピラリーの陰極側に“蓋”となるようなイオンを注入します。これはleading液と呼ばれています。
 この状態でleading液を陽極側に動かすような圧力をかけながら電圧を同時に印加すると、leading液は陽極に移動していくけれども、電圧がかかっている試料溶液内の陽イオンは陰極側に移動していきます。
 しかし陽イオンはいずれ少しずつ陽極側に移動するleading液に行く手を阻まれ、そこにとどまってしまい、続々とleading液との境界に集まってきます。
 このままleading液を完全に陽極側に移動するまで移動させ、その後通常通りCE分析をかけることで、2000倍以上も濃縮された試料溶液を分析することができるのです。


 CEの出口でESIを行うことで、MSと接続することもできます。これをCE-MSといいます。
 CEで様々な分子を分離し、MSでその分子を順番に検出して構造解析することで、どんな試料がどのくらいの量含まれているのかを網羅的に分析することができます。
 下の画像は実際にCE-MS (トリプル四重極MS) を使ってナフチルアミンとアミノピレンを混合した試料を分析したデータです。
 それぞれ2つのピークとして化合物が検出されているのがわかります。

Gの後の数字はいくつのグルコースが結合しているかを示している。G15は非常に量が少なくピークとしては検出されづらくなる。